Cultivo de hibridomas en el CellMaker: Ejemplo práctico de la Producción de anticuerpos monoclonales

Introducción

MTB presenta el bioreactor  CellMaker de Cellexus para optimizar el cultivo de células de mamíferos.

Los anticuerpos son proteínas del sistema inmunológico que identifican y neutralizan las proteínas o antígenos extraños. Presentan un alto nivel de especificidad y afinidad: dos características funcionales claves que permiten que los anticuerpos se utilicen como una herramienta integral en la investigación, el diagnóstico y de forma terapéutica. La inmunoterapia está adquiriendo un impulso excepcional en la comunidad científica, con un número récord de anticuerpos a los que se ha concedido la aprobación inicial en la Unión Europea y los Estados Unidos en 2018 (1).

En comparación con los anticuerpos policlonales, los anticuerpos monoclonales (mAbs) suelen tener una mejor consistencia entre lotes y una menor reactividad de fondo, lo que les permite ser una herramienta útil para la investigación y las aplicaciones “in vivo”. Según un informe de 2017, se prevé que el mercado de anticuerpos monoclonales crezca de 403,7 millones de dólares en 2017 a 1.151,5 millones de dólares en 2022 (2), lo que muestra el potencial de esta aplicación. La tecnología del hibridoma fue el primer método de producción de mAb que permitió la investigación científica in vitro y sigue siendo la plataforma principal y preferida para la funcionalización de mAb (3).

Una de las formas más comunes y tradicionales de cultivar células de hibridoma es utilizando frascos almacenados en incubadoras. Prepararlos y mantenerlos puede ser un trabajo extensivo y a menudo se producen resultados inconsistentes debido a los puntos calientes y fríos de las incubadoras, al alto riesgo de contaminación y al error humano, lo que indica lo laborioso que es mantener el cultivo.

El Dr. Jean-Christophe Bourdon, Jefe del laboratorio de isoformas p53 de la Universidad de Dundee, y su equipo han estado utilizando un sistema CellMaker Plus 8L para producir eficazmente una gama de anticuerpos p53 a partir de células de hibridoma murino. En este experimento, se realizaron cultivos por lotes tanto en el CellMaker como en frascos, y se comparó la producción de dos diferentes anticuerpos monoclonales de ratón.

 

Metodología

Para este experimento, se utilizaron dos métodos de producción de dos anticuerpos monoclonales en paralelo: el método tradicional utilizando un frasco (flash) y el sistema CellMaker. El método para cada experimento se detalla a continuación:

Método del frasco

Bajo una campana extractora, se prepararon frascos y se almacenaron en una incubadora de 37°C. Se revisaron rutinariamente en cada paso del experimento para asegurar que no había contaminación.

Método CellMaker

Se usó un sistema CellMaker Plus, que permite monitorear y controlar el pH y el oxígeno disuelto del medio. Bajo una campana extractora, la bolsa estéril del biorreactor Cellexus fue equipada con dos filtros PTFE 0.2μm y una sonda de pH autoclavada. La bolsa vacía se colocó en el soporte del CellMaker, las células, el medio y el suero se bombearon a la bolsa del biorreactor CellMaker a través de una bomba peristáltica y un tubo estéril. Para ambos experimentos, se fijaron los siguientes parámetros en el software:

Métodos de purificación

En este experimento se utilizó la técnica de purificación de la proteína A/G para ambos métodos de producción. Esta puede ser sustituida por la cromatografía de afinidad peptídica o cualquier otra técnica de purificación preferida.

 

Resultados

Los resultados del total de mAb producidos se detallan en la siguiente tabla. La cantidad de anticuerpos producidos del volumen total del CellMaker fue comparada con el volumen total que el Dr. Bourdon produciría típicamente en el experimento con frascos: 10 flasks de 30ml cada uno, lo que equivale a 300ml.

 

Anticuerpos monoclonales

Método de producción

Volumen total producido

Concentración mAb/ml

Total mAb producido

C-alpha

Flask

300 ml

17.45 μg/ml

5,235 μg

CellMaker

2000 ml

13.41 μg/ml

26,820 μg

mAb421

Flask

300 ml

16.67 μg/ml

5,001 μg

CellMaker

2300 ml

11.67 μg/ml

26,841 μg

 

Discusión

En los resultados se observa que el CellMaker aumenta la capacidad de producción comparado con lo métodos tradicionales, aumentando de forma significativa el número de anticuerpos generados durante el mismo tiempo. En comparación con los métodos tradicionales el CellMaker presenta varias ventajas: 1.- reduce la carga de trabajo ya que su controlador permite seguir y mantener las condiciones ideales de cultivo. 2.- el equipo requiere de poco espacio y permite la producción de entre 2 y 8L en el mismo reactor, cantidades significativamente mayores a las que tradicionalmente se obtienen en un frasco. 3.- Al contar con un sistema de control el equipo CellMaker permite obtener resultados reproducibles.

En comparación con otros biorreactores, el CellMaker es único con la tecnología de aireación por flujo de aire (o gas) y biorreactores de un solo uso. Esta tecnología es ideal para aumentar la eficiencia en el cultivo de células de mamíferos debido a su suave mezclado. Por el contrario, en los biorreactores clásicos donde la mezcla se realiza con paletas de agitación se corre el riesgo de romper las membranas celulares. El CellMaker además elimina la necesidad de esterilización y validación entre lotes, gracias a que las bolsas de reacción de un solo uso tienen certificado de esterilización y son desechadas tras su uso, reduciendo significativamente el riesgo de contaminación cruzada. Los paneles laterales transparentes del CellMaker también permiten mejor control visual que en los típicos sistemas de acero inoxidable.

Tiempo de trabajo y espacio

Para poder reproducir los resultados del CellMaker serían necesarios 267 frascos  y una significativa carga de trabajo, numerosas horas para preparar y cultivar. Además, cada uno de los frascos debe ser revisado durante la semana para asegurar que no hay contaminación. Este tipo de carga de trabajo y espacio de almacenamiento de la incubadora no es práctico.

En cambio, el CellMaker requería aproximadamente cinco minutos para prepararse, tres minutos para cosechar y sin necesidad de tiempo adicional para mantenerlo. Comprobar la contaminación era tan simple como mirar a través de los paneles frontales del biorreactor transparente.

Además, este reactor puede colocarse en una vitrina o mesa y no requiere espacio en una incubadora, ya que el sensor Peltier instalado en el recinto es una forma precisa y exacta de controlar la temperatura.

Control preciso y reproducibilidad

El CellMaker mantuvo la temperatura y el pH constantes durante todo el experimento. Comparado con el almacenamiento en incubadora que puede contaminarse fácilmente y tener puntos calientes y fríos, el CellMaker mantiene el contenido estéril y ofrece un ambiente mucho más estable para que las células crezcan y se dividan.

El cambio de color del medio debido a la producción de ácido láctico es una indicación visual de que el experimento necesita atención, ya que la producción de anticuerpos se está desacelerando, esto ocurre cuando la acidez del medio disminuye y corre el riesgo de degradar la calidad del anticuerpo. Aunque esto se observó en los cultivos en frasco, el en el sistema automático, el pH se corrigió automáticamente para mantenerlo entre valores de 7,3 y 7,5. De esta forma se evitó el cambio de color, lo que indica que las células permanecen en un metabolismo normal, permitiendo el crecimiento a largo plazo y la producción de anticuerpos sin aumentar el costo y la mano de obra. Manteniendo el pH en estos valores permite una mejor calidad de los anticuerpos.

 

Conclusiones

En los métodos clásicos es más difícil controlar el oxígeno disuelto, la acidez o el CO2 en el cultivo celular, lo que complica mucho el cultivo de largo plazo y limita significativamente la producción de anticuerpos. La gran estabilidad y control del CellMaker permite trabajar con cultivos a largo plazo y grandes cantidades con unas condiciones reproducibles que permite obtener grandes volúmenes y anticuerpos de gran calidad.

Para la misma cantidad de tiempo, pero con mucha menos carga de trabajo y mano de obra, el CellMaker proporcionó una solución para aumentar la producción de anticuerpos cinco veces, en comparación con la producción de frascos. Los futuros experimentos deberían probar cuánto tiempo se podría mantener el cultivo en el CellMaker antes de que los medios comiencen a acidificarse para evaluar el potencial de una producción de anticuerpos aún mayor. Estos resultados muestran que el CellMaker es una forma práctica de aumentar la producción de anticuerpos de manera más sencilla y fiable que con los métodos tradicionales en múltiples frascos.

Cellexus International and  Dr. Jean-Christophe Bourdon, University of Dundee

Referencias

1. Kaplon, H., & Reichert, J. M. (2018). Antibodies to watch in 2019. MAbs, 11(2), 219–238. doi: 10.1080/19420862.2018.1556465

2. Zaroff, S., & Tan, G. (2019). Hybridoma technology: the preferred method for monoclonal antibody generation for in vivo applications. BioTechniques, 67(3), 90–92. doi: 10.2144/btn-2019-0054

3. Kalia, R. (2017). Single Use Bioreactor Market Global Forecast to 2022. Markets and Markets, pp. 1–207.

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